تحقیق بررسی خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی جدایه های بزی پاستورلا مولتوسیدا در word

 تحقیق بررسی خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی جدایه های بزی پاستورلا مولتوسیدا در word دارای 80 صفحه می باشد و دارای تنظیمات و فهرست کامل در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد تحقیق بررسی خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی جدایه های بزی پاستورلا مولتوسیدا در word  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

این پروژه توسط مرکز مرکز پروژه های دانشجویی آماده و تنظیم شده است

توجه : توضیحات زیر بخشی از متن اصلی می باشد که بدون قالب و فرمت بندی کپی شده است

بخشی از فهرست مطالب پروژه تحقیق بررسی خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی جدایه های بزی پاستورلا مولتوسیدا در word

چکیده  
مقدمه  
فصل اول: کلیات  
بخش اول- کلیات  
طبقه بندی  
1-1-خانواده پاستورلا سه(Pasteurellace )   
2 -1-1- جنس پاستورلا(Pasteurella  )  
2-1- پاستورلا مولتوسیدا  
1-2-1- تاریخچه  
بخش دوم: 2-2-1- جداسازی و خصوصیات بیوشیمیایی و کشت  
3-2-1واکنش های بیوشیمیایی  
4-2-1- روشهای تعیین تیپ  
1-4-2-1- روشهای تعیین فنوتیپ  
الف- تقسیم بندی بر اساس شکل کلنی  
ب- روشهای سرمی  
روش روبرت  
روش کارتر  
روش نامیوکا و موراتا  
روش هدلستون  
ج- روشهای بیوشیمیایی  
روش تعیین تحت تیپ   
بخش سوم:3-1- بیماریزایی  
1-5-2-1-سپتی سمیک هموراژیک   
2-5-2-1-پنومونی در گاو ،گوسفند،خوک  
پنومونی در گوسفند  
پنومونی گاوی  
3-5-2-1-رینیت آتروفیک در خوک   
4-5-2-1- وبای مرغان  
بخش چهارم: 5-1- عوامل حدّت در پاستورلا مولتوسیدا   
1-5-1- کپسول ( CAPSUL )  
نقش کپسول در بیماریزائی  
الف:  نقش ضد فاگوسیتوز  
ب:  مقاومت در برابر خشکی  
ج:  قدرت تداخل با دستگاه کمپلمان  
د:  قدرت چسبیدن به سلولهای میزبانی  
2-5-1- لیپوپلی ساکارید ( Lipopolysaccharid )  
3-5-1- فیمبریه و پروتئین های چسباننده(Adhesine)  
4-5-1-توکسینها  
5-5-1-پروتئینهای تنظیم کننده و اکتساب کننده آهن  
بخش پنجم: مروری بر مطالعات گذشته  
فصل د وّم :مواد و روشها   ( Material & Methodes )  
1-2- وسایل  
1-2-2- دستگاهها   
2-2-2- مواد    
-الیگونوکلئوتیدهای مورد استفاده برای انجام PCR  
- آنزیم ها  
- نشانگرهای وزن مولکولی DNA   
- محلولها و بافرهای مورد نیاز برای الکتروفورز ژل آگارز  
2-1-9-4- محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت انجام PCR  
1-2-  مرحله نمونه برداری  
2-2- مرحله کشت ،جداسازی وتعیین هویت جدایه ها  
الف-2-2- روش کار  
ب – مرحله تعیین هویت  
3-2- روش تعیین بیوتیپ جدایه های پاستورلا مولتوسیدا   
4-2-تعیین تیپ کپسولی  جدایه ها با استفاده از روش  Multiplex-PCR  
- الکتروفورز DNA با ژل آگارز   
تعیین حضور  ژنهای دخیل در ویرولانس با استفاده از روش Multiplex-PCR
( toxA  )- ( tbpA ) – (pfha1 )   
فصل ســــوّم : نـتـایـج  
نتایج نمونه برداری  
نتایج  کشت و جداسازی   
نتایج فنوتایپینگ  جدایه ها   
نتایج کپسولار تایپینگ در جدایه ها   
نتایج ویرولانس تایپینگ در جدایه ها   
فصل چهارم : بحث  
منابع  

بخشی از فهرست مطالب پروژه تحقیق بررسی خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی جدایه های بزی پاستورلا مولتوسیدا در word

1- زهرائی صالحی،ت،  شایق، ج ،1386، میکروب شناسی دامپزشکی وبیماریهای میکروبی (بخش بیماریهای باکتریائی)، انتشارات دانشگاه تهران

2-Angen, O., Mutters, R., et al.1999.Taxonomic relationships of the (Pasteurella ) haemolytica complex as evaluated by DNA–DNA hybridizations and 16S rRNA sequencing with proposal of Mannheimia haemolytica gen.nov., comb.nov., Mannheimia glucosida sp.nov.,

3- Angen O, Christensen H, Bisgaard M, Frederiksen W, Olsen JE (2005) Characterization of sucrose-negative Pasteurella multocida variants, including isolates from large-cat bite wounds. J Clin Microbiol 43(1):259-

4-Benkirane A., De Alwis M.C.L.(2002) Hemorrhagic septicaemia, its significance, prevention, and control in Asia.Vet Med Czech, 47, 234-

5- Blackall PJ, Christensen H, Beckenham T, Blackall LL, Bisgaard M (2005) Reclassification of Pasteurella gallinarum, [Haemophilus] paragallinarum, Pasteurella avium and Pasteurella volantium as Avibacterium gallinarum gen. nov., comb. nov., Avibacterium paragallinarum comb. nov., Avibacterium avium comb. nov. and Avibacterium volantium comb. nov Int J Syst Evol Microbiol 55(Pt 1):353-

6- Blackall PJ. Fernndez RP, Colndres HL, Velsquez QE, Soriano VE (2005) Protection conferred by bivalent and trivalent infectious coryza bacterins against prevalent serovars of Avibacterium (Haemophilus) paragallinarum in Mexico. Avian Dis 49(4):585-

7- Blackall PJ, Bojesen AM, Christensen H, Bisgaard M (2007) Reclassification of [Pasteurella] trehalosi as Bibersteinia trehalosi gen. nov., comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol 57(Pt 4):666-

8-Blackall, P.J., Pahoff, J.L., Marks, D., Fegan, N.and Morrow, C.J., 1995.Characterization of Pasteurella multocida isolates from fowl cholera outbreaks on seven turkey farms.Aust.Vet.J

9-Boerlin, P., Siegist, H.H., Burnens, A.P., Kuhnert, P., Mendez, P., Pretat, G.,13 Lienhard, R., Nicolet, J., 2000.Molecular identification and epidemiological tracing 14 of Pasteurella multocida meningitis in a baby.J.Clin.Microbiol.38, 1235-

10-Bosch M, Garrido E, Llagostera M, de Rozas AMP, Badiola I &Barbe J (2002a) Pasteurella multocida exbB, exbD and tonB genes are physically linked but independently transcribed.FEMS Microbiol Lett 210: 201–208

11-Bosch M, Garrido ME, Llagostera M, de Rozas AMP, Badiola I & Barbe J (2002b) Characterization of the Pasteurella multocida hgbA gene encoding a hemoglobin-binding protein.Infect Immun 70: 5955–5964

12-Boyce JD &Adler B (2000) The capsule is a virulence determinant in the pathogenesis of Pasteurella multocida M1404 (B:2).Infect Immun 68: 3463–3468

13-Boyce JD, Cullen PA, Nguyen V, Wilkie I & Adler B (2006) Analysis of the Pasteurella multocida outer membrane subproteome and its response to the in vivo environment of the natural host.Proteomics 6: 870–880

14- Broom A, Sneath PH (1981) Numerical taxonomy of Haemophilus. J Gen Microbiol 126(1):123-

15- Bruner, W.D.,Gillespie., 1973.Hagan’s Infectious diseases of domestic animals, 6thComstock, Cornell.PP173-

16-Capitini CM, Herrero IA, Patel R, Ishitani MB & Boyce TG (2002) Wound infection with Neisseria weaveri and a novel subspecies of Pasteurella multocida in a child who sustained a tiger bite.Clin Infect Dis 34: e74–e

17-Carter, G.R., (1955).Studies on Pasteurella multocida: a haemagglutination test for the identi.cation of serological types.American Journal of Veterinary Research 16, 481–484

18-Carter, G.R., De Alwis, M.C.L., (1989).Haemorrhagic septicemia.In Pasteurella and Pasteurellosis, pp.131–160Edited by C.F.Adlam ,.J.M.Rutter.London: Academic Press

19-Catry B.(2005).Pasteurella and Mannheimia species from calves: differentiation and antimicrobial resistance, PhD thesis, Ghent University, Merelbeke, Belgium

20- Chandrasekaran S, Hizat K, Saad Z, Johara MY, Yeap PC (1991) Evaluation of combined Pasteurella vaccines in control of sheep pneumonia. Br Vet J 147(5):437-

21-Chanter, N., Rutter, J.M.,(1989).Pasteurellosis in pigs and the determinants of virulence of toxigenic Pasteurella multocida.In Pasteurella and Pasteurellosis, pp.161–195Edited by C.F.Adlam & J.M.Rutter.London: Academic Press

22-Choi-Kim K, Maheswaran SK, Felice LJ & Molitor TW (1991) Relationship between the iron regulated outer membrane proteins and the outer membrane proteins of in vivo gown Pasteurella multocida.Vet Microbiol 28: 75–92

23-Christensen, H., Bisgaard, M., et al.2003c.Genetic relationships among avian isolates classified as Pasteurella haemolytica , Actinobacillus salpingitidis or Pasteurella anatis with proposal of Gallibacterium anatis gen.nov., comb.nov.and description of additional genomospecies within Gallibacterium gen.nov.Int J Syst Evol Microbiol, 53 , 275-

24-Christensen, H., Bisgaard, M., Angen, ., Frederiksen, W., Olsen, J.E., 2005.Characterization of sucrose negative variants of Pasteurella multocida including isolates from large cat bite-wounds.J.Clin.Microbiol.43, 259-

25- Christensen H, Bisgaard M, Bojesen AM, Mutters R, Olsen JE (2003) Genetic relationships among avian isolates classified as Pasteurella haemolytica, ‘Actinobacillus salpingitidis’ or Pasteurella anatis with proposal of Gallibacterium anatis gen. nov. comb. nov. and description of additional genomospecies within Gallibacterium gen. nov. Int J Syst Evol Microbiol (Pt 1):275-

26- Christensen TK ,Pedersen K, Dietz HH, Jrgensen JC, Bregnballe T, Andersen TH (2003) Pasteurella multocida from outbreaks of avian cholera in wild and captive birds in Denmark. J Wildl Dis 39(4):808-

27-Cundell DR, Gerard NP, Gerard C, Idanpaan-Heikkila I & Tuomanen EI (1995)Streptococcus pneumoniae anchor to activated human cells by the receptor for platelet-activating factor.Nature 377: 435–438

28-Davies, R.L., MacCorquodale, R., Caffrey, B., 2003.Diversity of avian Pasteurella multocida strains based on capsular PCR typing and variation of the OmpA and OmpH outer membrane proteins.Vet.Microbiol.91, 169-

29-Davies, R.L., MacCorquodale, R., Reilly, S., 2004.Characterisation of bovine strains 2 of Pasteurella multocida and comparison with isolates of avian, ovine and porcine 3 origin.Vet.Microbiol.99, 145-

30- De Alwis MC (1981) Mortality among cattle and buffaloes in Sri Lanka due to haemorrhagic septicaemia. Trop Anim Health Prod 13(4):195-

31- Dziva F, Mohan K, Pawandiwa A (2001) ) Capsular serogroups of Pasteurella multocida isolated from animals in Zimbabwe. Onderstepoort J Vet Res 67(4):225-

Trop Anim Health Prod 22(3):185-

32-Dziva, F., Muhairwa, A., Bisgaard, M., Christensen, H.(2007),Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida, Veterinary Microbiology, doi:10.1016/j.vetmic

33- De Alwis MC, Wijewardana TG, Gomis AI, Vipulasiri AA (1989) Persistence of the carrier status in haemorrhagic septicaemia (Pasteurella multocida serotype 6:B infection) in buffaloes

34-Ewers, C., Lu¨bke-Becker.A., Bethe.A., Kieling.S., Filter.M., Wieler, L.H.(2006)  Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status.Veterinary Microbiology 114, 304–

35-Fegan, N., Blackall, P.J., Pahoff, J.L., (1995).Phenotypic characterization of Pasteurella multocida isolates from Australian poultry.Vet.Microbiol.47, 281-

36-Foster, G., Ross, H.M., et al.2000.Phocoenobacter uteri gen.nov., sp.nov., a new member of the family Pasteurellaceae Pohl (1979) 1981 isolated from a harbor porpoise ( Phocoena phocoena ).Int J Syst Evol Microbiol, 50 , 135-

37-Frank, G.H., (1989).Pasteurellosis of cattle.In Pasteurella and Pasteurellosis, pp.197–222Edited by C.F.Adlam, J.M.Rutter.London: Academic Press

38- Frebourg NB, Berthelot G, Hocq R, Chibani A, Lemeland JF (2002) Septicemia due to Pasteurella pneumotropica: 16S rRNA sequencing for diagnosis confirmation. J Clin Microbiol 40(2):687-

39-Fuller TE, Kennedy MJ & Lowery DE (2000) Identification of Pasteurella multocida virulence genes in a septicemic mouse model using signature-tagged mutagenesis.Microb Pathog 29: 25–38

40-Galdiero M, Folgore A, Nuzzo I & Galdiero E (2000) Neutrophil adhesion and transmigation through bovine endothelial cells in vitro by protein H and LPS of Pasteurella multocida.Immunobiology 202: 226–238

41- Gilmour NJL (1978) Pasteurellosis in sheep.Vet Rec 102:100–102

42- Gilmour NJ,  Abdullahi MZ, Poxton IR (1989) Identification of non-haemolytic pasteurellae cultured from the lungs of cattle. Vet Rec 125(7)

43- Gilmour JS , Jones GE, Donachie W, Sutherland AD, Knox DP (1989) : Protection of lambs against experimental pneumonic pasteurellosis by transfer of immune serum. Vet Microbiol 20(1):59-

44-Glisson JR,Contreras MD, Cheng IHN & Wang C (1993) Crossprotection studies with Pasteurella multocida bacterins prepared from bacteria propagated in iron-depleted medium.Avian Dis 37:1074–1079

45-Gay-Owen SD & Schryvers AB (1996) Bacterial transferrin and lactoferrin receptors.Trends Microbiol 4: 185–191

46-Harper M, Boyce JD, Wilkie IW &Adler B (2003) Signaturetagged mutagenesis of Pasteurella multocida identifies mutants displaying differential virulence characteristics in mice and chickens.Infect Immun 71: 5440–5446

47-Harper, M.Boyce, J.D., and Adler, B.(2006): Pasteurella multocida pathogenesis: 125 years after Pasteur.FEMS Microbiol Lett.265:1–

48- Heddleston, K.L., Gallagher, J.E., Rebers, P.A., (1972).Fowl cholera:gel di.usion precipitation test for serotyping Pasteurella multocidarom avian species.Avian Diseases 16, 925–936

49- Ishiguro K, Kitajima T, Kubota S, Amimoto K, Oda K, Fukuyama S, Shimizu Y (2005) ) Experimental infection of calves with Pasteurella multocida Serovar A: 3 isolated in Japan. J Vet Med Sci 67(8):817-

50- Janda, W.M and Muttere, R., 2006.Pasteurella, Mannheimia, Actinobacillus, Eikenella, Kingella, Capnocytophaga, and other miscellaneous gam-negative rods.In: Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 10 Ed.(Arnold, E.Ed.), pp.951649–1691Health Sciences Marketing Department, London

51-Kennett L, Muniandy N & Mukkur TKS (1993) Comparative Protective Potential of Non-living Intact Cells and Purified Outer Membrane and Associated Proteins of Pasteurella multocida Type B:6 Gown Under Iron-Regulated Conditions.In: Pasteurellosis in Production Animals, ACIAR Proceedings No.43 (Patten BEea, ed.), pp.144–149ACIAR Press, Canberra

52-Kuhnert, P., Boerlin, P., Emler, S., Krawinkler, M., Frey, J., 2000.Phylogenetic analysis of Pasteurella multocida subspecies and molecular identification of feline P.multocida subsp.septica by 16S rRNA gene sequencing.Int.J.Med.Microbiol.290, 599-

53- Kuhnert P, Korczak B, Falsen E, Straub R, Hoops A, Boerlin P, Frey J, Mutters R (2004) Nicoletella semolina gen. nov., sp. nov., a new member of Pasteurellaceae isolated from horses with airway disease. J Clin Microbiol 42(12):5542-

54-May BJ, Zhang Q, Li LL, Paustian ML, Whittam TS & Kapur V (2001) Complete genomic sequence of Pasteurella multocida, Pm70.Proc Natl Acad Sci USA 98: 3460–3465

55-Mutters, R., Ihm, P., Pohl, S., Frederiksen, W., Mannheim, W., (1985).Reclassification of the genus Pasteurella Trevisan 1887 on the basis of deoxyribonucleic acid homology, with proposals for the new species Pasteurella dagmatis, Pasteurella canis, Pasteurella stomatis, Pasteurella anatis, and Pasteurella langaa.Int J Syst Bacteriol 35, 309–322

56- Mutters R, Bisgaard M, Pohl S (1986) Taxonomic relationship of selected biogroups of Pasteurella haemolytica as revealed by DNA:DNA hybridizations. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand [B] 94(3):195-

57- Mutters R , Bisgaard M (1986) Re-investigations of selected bovine and ovine strains previously classified as Pasteurella haemolytica and description of some new taxa within the Pasteurella haemolytica-complex. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand [B] 94(3):185-

58- Mutters R , Bisgaard M (1986) Characterization of some previously unclassified “Pasteurella” spp. obtained from the oral cavity of dogs and cats and description of a new species tentatively classified with the family Pasteurellaceae Pohl 1981 and provisionally called taxon 16. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand [B] 94(3):177-

59- Odugbo MO, Okpara JO, Abechi SA, Kumbish PR (2005) An outbreak of pneumonic pasteurellosis in sheep due to Mannheimia (Pasteurella) haemolytica serotype 7. Vet J 167(2):214-

60-Ogunnariwo JA & Schryvers AB (2001) Characterization of a novel transferrin receptor in bovine strains of Pasteurella multocida.J Bacteriol 183: 890–896

61-Osawa, R., Rainey, F., et al.1995.Lonepinella koalarum gen.nov., sp.nov., a new tannin-protin complex degading bacterium.Syst Appl Microbiol, 18 , 368-

62-Pullinger GD, Bevir T & Lax AJ (2004) The Pasteurella multocida toxin is encoded within a lysogenic bacteriophage.Mol Microbiol 51: 255–269

63- Quinne P.J., Carter M.E., Markey B., Carter G.R.(1994): Pasteurella species.In: Clinical Veterinary Microbiology.Wolfe Publishing, Mosby – Year Book Europe Limited, London.254–258

64-Rimler RB & Rhoades KR (1989) Pasteurella multocida.In: Pasteurella and Pasteurellosis (Adlam C & Rutter JM, Eds), pp.37–73Academic Press Limited, London

65-Ruffolo CG, Tennent JM, Michalski WP & Adler B (1997) Identification, purification, and characterization of the type 4 fimbriae of Pasteurella multocida.Infect Immun 65: 339–343

66-Ruffolo CG, Jost BH & Adler B (1998) Iron-regulated outer membrane proteins of Pasteurella multocida and their role in immunity.Vet Microbiol 59: 123–137

67-Schenkein HA, Barbour SE, Berry CR, Kipps B & Tew JG (2000) Invasion of human vascular endothelial cells by Actinobacillus actinomycetemcomitans via the receptor for platelet-activating factor.Infect Immun 68: 5416–5419

68- Serino L &Virji M (2002) Genetic and functional analysis of the phosphorylcholine moiety of commensal Neisseria lipopolysaccharide.Mol Microbiol 43: 437–448

69- Shivachandra S.B, A.A.Kumar, R.Gautam, Vijendra P.Singh,M.K.Saxena, S.K.(2005)Identi.cation of avian strains of Pasteurella multocida in India by conventional and PCR assaysThe Veterinary Journal ARTICLE IN PRESS

70-Sotoodehnia A, Vand Yosefi  J,Aarabi I.(1986): Isolation and typing of Pasteurella multocida  poultry isolates from Iran, Archive  of Razi Institute.36,37:85-

71- Sneath PH, Stevens M (1990) Actinobacillus rossii sp. nov., Actinobacillus seminis sp. nov., nom. rev., Pasteurella bettii sp. nov., Pasteurella lymphangitidis sp. nov., Pasteurella mairi sp. nov., and Pasteurella trehalosi sp. nov. Int J Syst Bacteriol 40(2):148-

72-Snipes KP, Hansen LM & Hirsh DC (1988) Plasma- and ironregulated expression of high molecular weight outer membrane proteins by Pasteurella multocida.Am J Vet Res 49: 1336–1338

73-St Michael F, Li J, Vinogadov E, Larocque S, HarperM& Cox AD (2005b) Structural analysis of the lipopolysaccharide of Pasteurella multocida strain VP161: identification of both Kdo-P and Kdo-Kdo species in the lipopolysaccharide.Carbohyd Res 340: 59–68

74-Swords WE, Buscher BA, Ver Steeg Ii K, Preston A, Nichols WA, Weiser JN, Gibson BW &Apicella MA (2000) Non-typeable Haemophilus influenzae adhere to and invade human bronchial epithelial cells via an interaction of lipooligosaccharide with the PAF receptor.Mol Microbiol 37:13–27

75-Tatum FM, Yersin AG & Briggs RE (2005) Construction and virulence of a Pasteurella multocida fhab2 mutant in turkeys.Microb Pathog 39: 9–17

76-Townsend KM, Boyce JD, Chung JY, Frost AJ & Adler B (2001) Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system.J Clin Microbiol 39: 924–929 (Erratum in J.Clin.Microbiol.(2001) 2039, 2378)

بخش اول- کلیات

طبقه بندی:

1-1-خانواده پاستورلا سه(Pasteurellace )

 بر اساس آخرین طبقه بندی 13 جنس مهم خانواده پاستورلاسه تا سال 2008 عبارتنداز

خانواده پاستورلاسه (Pasteurellacea ) یک خانواده وسیع و متنوع ازپروتئوباکتریهای گرم منفی بنام گاما پروتئوباکتر که دسته ای ازارگانیزمهای گرم منفی میله ای اند که در انسان و حیوانات ایجاد بیماری می کنند.علاوه بر جنس پاستورلا(Pasteurella)، منهمیا (Mahemia)و اکتینو باسیلوس ها(Actionobacillus ) و هموفیلوسها از سایر باکتریهای مهمی هستند که در این دسته حضور دارند.بجز بیماری حاصل از اکتینو باسیلوس، اکتینومیستوکومیتانس(A.actinomycetemcomitans) و چند گونه دیگر اعضای این گروه عمدتا موجب عفونتهایی در انسان می‌گردند که بواسطه گاز گرفتگی یا خراش بواسطه حیوانات حاصل می آیند

2 -1-1- جنس پاستورلا(Pasteurella  )

در حال حاضر طبقه بندی مناسبی برای جنسهای این خانواده مفروض نیست و دانشمندان در تلاشند جنسها و گونه‌های مختلف متعلق به این خانواده را به نحو شایسته ای طبقه بندی نمایند. تا سال 2008 تعداد  جنســهای این گونه تا 14 جنس رسیده است.  مطالــعــات دورگــه ســازی DNA           (DNA hybrizdation) ما بین اعضای این خانواده بیش از 50 درصد همولوگی را نشان داده است . از سال 1985 گونه‌های جدیدی به جنس پاستورلا یا اکتینوباسیلوس اضافه گردیده است . مطالعات بر روی rRNA S 16 نشان داد که گونه‌هایی که سابقا” پاستورلا خوانده می‌شدند همانند پاستورلا پنوموتروپیکا (P.penomotropica)، پاستورلا اوره آ(P.ureae)، پاستورلا آئروژن(P.aerogen)  و پاستورلا همولایتیکا (P.heamolytica) اصولا پاستورلای واقعی(Pasturella senus stricto) نبوده و احتمالا می‌بایستی  در جنس اکتینو باسیلوس و یا در جنس جدیدی قرار گیرند( Janda, 2006)

در قدم اول برای حل چنین مشکلی  1- پاستورلا اوره آ به جنس اکتینو باسیلوس انتقال داده شده و اکتینو باسیلوس اوره آ خوانده شدMutters et al. 1986 )  (  2- پاستورلا آناتیس به گالی باکتریوم انتقال داده شده و گالی باکتریوم آناتیس خوانده شد( Mutters et al. 1985)  3-  پاستورلا  اویوم به هموفیلوس انتقال و هموفیلوس اویوم خوانده شد( Mutters et al. 1986)   4 – پاستورلا گالیناروم  به اوی باکتریوم انتقال و اوی باکتریوم گالیناروم خوانده شد ( Blackall et al 2005)   5- پاستورلا گرانولو ماتیس به منهمیا  منتقل و منهمیا گرانولوماتیس خوانده شد (  Angen et al 1999)  6- پاستورلا همولایتیکا به منهمیا منتقل و منهمیاهمولایتیکا خوانده شد 7- پاستورلا لیمفانژیتیس نیز از  انتروباکتریاسه به پاستورلا  منتقل شد 8- پاستورلا تره هالوزی تیپ T ابتدا به پاستورلا همولایتیکا و سپس به بی برشتاین منتقل و بی برشتاین تره هالوزی   خوانده شد (Blackall et al 2007)

 در حال حاضر درجنس پاستورلا  گونه های ذیل شناسائی شده اند

1)      مولتوسیداو تحت گونه های ( مولتوسیدا ، گالیسیدا ،سپتیکا )

2)      پاستورلا پنوموتروپیکا

3)      پاستورلا تستودینیز

4)      پاستورلا  آئروژنز

5)      پاستورلا کنیس

6)      پاستورلا  داگماتیس

7)      پاستورلا لانگه آتیس

8)      پاستورلا استوماتیس

9)      پاستورلا   بتییه ئی

10) پاستورلا کابالی

11) پاستورلامیرئی

12) پاستورلا اسکینزی

این باکتری از نقطه نظر رده بندی در سلسله باکتریها ،شاخه پروتئوباکتریا ، کلاس گاما پروتئوباکتریا، خانواده پاستورلاسه،جنس پاستورلا و گونه مولتوسیدا قرار گرفته است

 در حال حاضر در این جنس گونه های مختلفی به شرح ذیل وجود دارند

در سال 1985، چندین گونه جدید پاستورلائی بر پایه دورگه سازی DNA توصیف گردید.این گونه‌ها شامل پاستورلا داگماتیس(P.dagmatis)، پاستورلا کانیس (P.canis)، پاستورلا استوماتیس(P.stomatis)، پاستورلا آناتیس(P.anatis)، پاستورلا لانگاآ (P.langaa) بودند. این گونه‌ها سابق بر این   بیوتیپ های هنریکسن(Henriksen)  پاستورلا پنوموتروپیکا خوانده می‌شدند،  در این میان  پاستورلا داگماتیس و پاستورلا کانیس بیوتیپ 6 پاستورلا مولتوسیدا را تشکیل می‌دادند

علی رغم تلاشهای فراوان برای تعریف اعضای واقعی جنس پاستورلا هنوز برخی از جنسها وجود دارند که احتمالا به دیگر جنسها انتقال یابند.از جمله این پاستورلاها می‌توان به پاستورلا بته ای (P.betteie )، پاستورلا کابالی (P.caballi)، پاستورلا تستودینیز ( P.testudiniz )، پاستورلا لنفانژیتیس، پاستورلا گرانول ماتیس ( P.ganulmatis ) می‌باشند.اکنون پاستورلا گرانولوماتیس به همراه برخی از بیوتیت های پاستورلا همولایتیکا به جنس جدید منهمیا انتقال یافته اند

خصوصیات بیوشیمیائی پاستورلا مولتوسیدا های واقعی در جدول -1-1  آورده شده است

 پاستورلاهای جدیدی که بصورت تک جدایه (single isolate ) جدا می‌گردند نیز به جمع پاستورلا اضافه شده‌اند اما تا کنون بدرستی مشخص نشده است که جایگاه طبقه بندی این دسته از پاستورلاهادرکجاقراردارد.پاستورلا اسکاینسیس ( P.skyensis ) از ماهی آزاد آتلانتیک از نقطه نظر توالی rRNA S 16  به پاستورلاها شباهت هایی را نشان می‌دهد.Kains و همکاران (2001) بر پایه توالی sRNA 23 پاستورلای جدیدی تحت عنوان پاستورلا لیژن (P.lesion) معرفی کردند.نهایتا سویه جدیدی از زیر گونه‌های پاستورلا مولتوسیدا جدا شده اززخم گاز گرفتگی یک کودک بنام پاستورلا مولتوسیدا تحت گونه تایگر (P.multocida sub tiger) معرفی شده است. از میان پاستورلاها، پاستورلا مولتوسیدا تحت گونه مولتوسیدا ((P.multocida sub multocida مولتوسیدا تحت گونه سپتیکا (P.multocida sub septica)،  پاستورلا کانیس، پاستورلا داگماتیس و پاستورلا استومایتیس به فراوانی از انسان جدا می‌شوند. پاستورلا همولایتیکا که عامل بسیاری از بیماریهای دامی است در حیوانات اهلی موجب بیماریهای اقتصادی شدیدی می‌شود. دامنه میزبانی آن شامل گاو، گوسفند، خوک و طیور و برخی حیوانات دیگر است (Janda, 2006)

 پاستورلا همولایتیکا از قبل به دو سویه پاستورلا همولایتیکا بیوتیپ A و T تقسیم می گردید.پاستورلا همولایتیکا بیوتیپ T  تخمیر کننده قند تره هالوز و بیوتیپ A موجب تخمیر قند آرابینوز می گردید.تیپ T  بیشتر با بیماریهای گوسفندی  و تیپ A با بیماریهای گاوی مرتبط بود.این بیوتیپها به نوبه خود به 17 سروتیپ تعلق داشتند که سروتیپهای 1، 2، 5 تا 9 و 11 تا 14 و 16 تا 17 متعلق به بیوتیپهای A و سروتیپهای 3 و 4 و 10 و 15 متعلق به بیوتیپ T بودند   (Mutter et al., 1985)

در سال 1985 تحول نسبتا بزرگی در طبقه بندی پاستورلا ها حاصل آمد. پاستورلا همولایتیکا نیز از این تحول بر کنار نماند. بیوتیپT  این پاستورلا بنام پاستورلا تره هالوزی((P.terhalosei) Sneath & (Stevens 1990) وسپس به    بی برشتاین تره هالوزی تغییر نام داد( ( Blackall et al. 2007.  بیوتیپ A آن نیز بر پایه MLEE، ریبو تایپینگ(ribotyping ) و توالی یابی rRNA S 16 به جنس جدیدمنهمیا انتقال یافته و نام منهمیا همولایتیکا(M.hemolytica) نام گرفت و یکی از سروتیپهای آن نیز بنام منهمیا گلوکوزیدا  (M.glucosida)شناخته شد (Mutter et al., 1985)

از نقطه نظر فعالیت های شیمیائی اعضای پاستورلا ها غیر متحرک، گرم منفی، بی هوازی اختیاری و کوکو باسیلی یا باسیلی اند.بسیاری از آنها اکسیداز مثبت و کاتالاز مثبت اند.فعالیت آلکالین فسفاتاز آنها مثبت بوده و نیترات را به نیتریت تبدیل می کنند.بسیاری از گونه ها قادر به تخمیر گلوکز، فروکتوز، مانوز، ساکاروز بوده ولی نشاسته و سالیسین را تخمیر نمی کنند (Quinne et al.,1994)

2-1- پاستورلا مولتوسیدا

پاستورلا مولتوسیدا یک باکتری میله ائی و کوکوباسیل گرم منفی که در ناحیه نازوفارنکس و دستگاه گوارش خیلی از حیوانات وحشی و اهلی یافت میشود . در انسان اغلب عامل سلولیتها و آبسه های موضعی متعاقب گزش و گازگرفتگی و خراشیدگی ها توسط حیوانات است  دستگاه گوارش دومین سایت عفونت برای پاستورلاهاست که تاکنون شناخته شده است. پاستورلاهای جدا شده از  عفونتهای انسانی را بیشتر پاستورلا مولتوسیدای تحت تیپهای مولتوسیدا و سپتیکا تشکیل می دهد . امروزه با استفاده از روشهای مولکولی ازجمله REA typing , REP-PCR Typing و کپسولار تایپینگ،تفریق و تعیین تحت گونه ها بسیار دقیق و آسان گردیده است

 

1-2-1- تاریخچه

حدود 125 سال از زمانی که اول بار لوئی پاستور (1880) باکتری عامل وبای طیور (fowl cholera) را جدا کرده است می‌گذرد (Harper et al., 2006).از آن زمان تا کنون پیشرفت های شگرفی در راه شناسایی این ارگانیزم صورت پذیرفته است.  پس از پاستور که این ارگانیزم را از طیور جدا کرد  دانسته شد که باسیل عامل وبای طیور نمی‌تواند چیز جدایی از عوامل سپتی سمی خرگوش          (rabbit septicemia)، طاعون خوک ( swine plague ) و پنومونی گاوان باشد.مشخصات یکسان این ارگانیزم ها و شباهت بیماری هایی که توسط آنها در حیوانات متنوع ایجاد می‌گردد موجب گشت تا Huppe    در سال 1886 آنها را تحت نام مشترک Bact.Septicemiae hemorhagicae در آورد

  Trevisanسال بعد بدلیل شباهت عوامل بیماریهای ایجاد شده توسط این ارگانیزم آنها را در یک جنس جای داده و به افتخار پدر میکروب شناسی جنس مذکور را Pasteurella نامیده و بیماریهای ایجاد شده توسط این باکتریها را Pasteurellosis نام نهاد. (Bruner and Gillespie., 1973)

 اگر چه عوامل جدا شده از میزبانهای مختلف از نکته نظر مرفولوژیکی و بیوشیمیائی تفاوت قابل ذکری نداشتند اما Flugger بسته به میزبانی که عامل را از آن جدا نموده بود سیستم نامگذاری خاصی را در خصوص باکتریهای این گونه بکار برد.بر اساس این سیستم باکتریهای جدا شده از طیور پاستورلا ایوی سپتیکا ( P.aviseptica) نام گذاری شده و بدین ترتیب باکتریهای خوکی P.suiseptica، گاوی boviseptica، گوسفندی oviseptica ، خرگوشی lepriseptica نامگذاری گردید.از آنجائیکه شیوه های شناسائی باکتریها در آن روزگاران هنوز قادر به تفکیک بین باکتریهای مورد نظر نبود لذا Kitt پیشنهاد کرد که نام گونه‌های مختلف را تحت یک گونه واحد و به عنوان پاستورلا مولتوسیدا جمع آورند.این پیشنهاد مقبول افتاده و تا به امروز در خصوص  سویه های مختلف این گونه باکتریا ئی بکار میرود(Bruner and Gillespie., 1973)

دیری نپائید که Moore پاستورلا مولتوسیدا را بعنوان فلور طبیعی از مخاطات طیف وسیعی از حیوانات اهلی و وحشی شامل گاو، گوسفند، خوک، سگ و گربه جدا کرد.این مطالعه ثابت کرد که گونه‌های جدا شده از عفونت حاد در گاو در خرگوش بیماریزائی چندانی ندارد

از آنروز تلاشهای بسیار فراوانی برای درک خصوصیات باکتری و طبقه بندی آن انجام یافته است.اولین تلاشها در این خصوص بر پایه خصوصیات کلنی از سویه های مختلف جدا شده استوار گردید.بر همین اساس پاستورلا مولتوسیدا به سه دسته تقسیم می‌شوند

دسته اول:باکتریها با کلنی موکوئیدی بودند که اندازه بزرگ و بافتی نرم داشته در محیط مایع نیز رسوب چسبناکی را دارا می باشند. این کلنی ها برای موش قدرت بیماریزائی متوسطی را دارا می‌باشند

دسته دوم:از کلنی های صاف فلور سنتی هستند که اندازه ای متوسط داشته و قوامی محکم را شامل می‌شوند.در محیط مایع بصورت منتشر رشد می یابند و حدت بالایی را برای موش دارند

دسته سوم:کلنی خشن (آبی) با اندازه ای کوچک و قوامی سخت را شامل می‌شوند و تمایل دارند در محیط بصورت خودبخود جمع شوند ( Autoaglutination). اعضا  این دسته از حدت کمی برای موش برخور دارند (Carter, 1955 )

کم کم روشهای آگلوتیناسیون، پرسیپتاسیون و تورم کپسولی نیز برای تعیین تیپ باکتری مذکور مورد استفاده واقع گردید. بر همین پایهRobert  آنها را در چهار گروه 1,2,3,4 قرار داده و Carter در چهار گروه A , B , C , D  طبقه بندی کرد.اگر چه روش Robert تقریبا هم ارز روش Carter بود اما نمی‌توانست بین تیپ B و D  روش کارتر تمایز قائل گردد.این امر موجب مقبولیت بیشتر روش کارتر گردید (Bruner and Gillespie., 1973)

روش کارتر که بر اساس هماگلوتیناسیون غیر مستقیم(Indirect Hemoglutination) استوار بود. پاستورلاها را در 4 تیپ A , B , C , D قرار داد.اقتصادی بودن بیشتر روش کارتر از محاسن مهم آن نسبت به روشهای هم ارز بود.در این روش آنتی ژنهای کپسولی اختصاصی استخراج و در معرض اریتروسیتهای گروه خونی O انسان در کنار آنتی سرمهای مختلف قرار می گرفت                   (Bruner and Gillespie., 1973)

در این روش تعدادی از سویه های پاستورلا مولتوسیدا یافت می شد که روش کارتر قادر به تعیین تیپ آنها نبود. مطابق روش کارتر تیپ A و B بیشتر در گاو دیده   می شد. تیپ A با پنومونی گاوی و تیپ B  با سپتی سمی هموراژیک ارتباط تنگاتنگی داشت. تیپA  همچنین موجب وبای طیور در میان ماکیان می گشت. تیپ D نیز عمدتا از خوک بهمراه تیپ A جدا می گشت. در سال 1963 کارتر تیپ جدیدی از پاستورلا مولتوسیدا را جدا نمود که تیپ E نامیده می شد. این تیپ با بیماری سپتی سمی هموراژیک در قاره سیاه در ارتباط بوده و خارج از این قاره گزارش نشده است                      (Bruner and Gillespie., 1973)

در سال 1987، Rimler و Roades تیپ جدیدی را به لیست پاستورلا مولتوسیداهای تعیین تیپ شده توسط Carter  افزوده و تیپ جدید را تیپ F نامیدند

در سال 1961 نامیوکاوموراتا بر اساس آنتی ژن پیکری ( somatic antigen ) توانستند پاستورلا مولتوسیدا را در    16 دسته سرمی قرار دهند.حدود یازده سال بعد یعنی در سال 1972، Heddleston و همکاران روش دیگری را بر پایه   آنتی ژن پیکری طراحی کردند.این روش که با روش نامیوکا و موراتا هم خوانی نداشت نیز پاستورلا مولتوسیدا را در 16 گروه سرمی جای داد و بخاطر سادگی انجام آن نسبت به روش نامیوکا و موراتا کم کم جای آن را گرفت.این روش که بر پایه روش رسوبی انتشار ژل استوار بود در کنار تست های بیوشیمیائی روش بسیار مناسبی برای طبقه بندی پاستورلا معرفی گردید

نتایج روشهای مذکور هم ارز با روش کارتر، ارزیابی گردید و تنها سروتیپهای محدودی  در داخل هر یک از تیپهای کپسولی  پیشنهادشده Carternhn  ، توان بیماریزائی در میزبانهای خاصی را دارند و بدین ترتیب سیستمهای آمیخته از تیپ های کپسولی وآنتی ژنهای  پیکری برای تعیین تیپ پاستورلا ها بکار گرفته شد (Bruner and Gillespie., 1973)

علی رغم پیشرفتهای شایانی که در طبقه بندی سرولوژیک باکتری مذکور به عمل آمده بود اما تنوع بیوشیمیائی این باکتری بخصوص در تخمیر کربوهیدراتها خود را بیش از بیش   نمود داد.بطوریکه در زمره تغییراتی که توسط Mutter  و همکاران بر اساس تشابهDNA – DNA  در خصوص طبقه بندی جنس پاستورلا انجام گرفت این امر نیز آشکار گردید که بر اساس تخمیر قند دلسیتول (dulcitol) و سوربیتول (sorbitol) می‌توان پاستورلا مولتوسیدا را در گروهای مختلفی قرار داد.بر همین اساس پاستورلا مولتوسیداها به بیوتیپ های پاستورلا مولتوسیدا بیوتیپ مولتوسیدا، پاستورلا مولتوسیدا بیوتیپ گالیسیدا و پاستورلا مولتوسیدا بیوتیپ سپتیکا تقسیم شدند.پاستورلا مولتوسیدا بیوتیپ گالیسیدا هر دو قند را تخمیر، پاستورلا مولتوسیدا بیوتیپ مولتوسیدا تنها قند سوربیتول را تخمیر و پاستورلا مولتوسیدا بیوتیپ سپتیکا هیچ کدام از قندها را تخمیر  نمی کرد.اخیرا تحت گونه جدیدی تحت عنوان  تایگریس نیز از کودکی که توسط پلنگ گاز گرفته شده بود جدا گردیده است Capitini et al., 2002).(

برخی از منابع برای پاستورلا مولتوسیدا تحت گونه مولتوسیدا دو واریانت A و B پیشنهاد کرده‌اند. در سال 1995، Blackall و همکاران توانستند بر اساس توانائی تخمیر قندهای L  - آرابینوز، دلسیتول، D- گلوکز، D- لاکتوز، مالتوز، D- مانیتول، D- سوربیتول، D- سوکروز،      D- تره هالوز و D- زایلوز و نیز انجام تستهای اورنیتین د کربوکسیلاز ( ODC ) و نیز تست بتا گالاکتوزیداز ترانسفراز پاستورلاها را در 16 بیوتیپ تقسیم نمایند.این روش تاکنون در جدایه‌های خوکی و طیور انجام گرفته ولی در سایر جدایه‌ها تجربه نشده است.محققین فوق روش خاص برای این آزمایش ابداع کرده‌اند که بنام Microplate fermatation method نامیده می‌شود

امروزه راههای بسیار متفاوتی برای مطالعه روابط مختلف پاستورلا مولتوسیدا جدا شده به منظور مطالعات اپیدمیولوژیکی ابداع شده‌اند.از روشهای بسیار مناسب می‌توان به روشهای REA، PFGE ، ریبو تایپنگ و روشهای مبتنی بر PCR اشاره کرد که محاسن و معایب هر یک به تفضیل در بخشهای آتی مورد بحث قرار خواهد گرفت

بخش دوم

2-2-1- جداسازی و خصوصیات بیوشیمیایی و کشت

نمونه‌های پاستورلایی بسته به نوع بیماری اندکی با هم متفاوت می‌باشند.در ضایعات پنومونیک نمونه می بایست از حاشیه ضایعه های پنومونیک ریه اخذ گردد در حالیکه در سپتی سمی نمونه‌های کبد , طحال , کلیه و غدد لنفاوی بسیار مهم میباشند.نمونه‌های پستانی درموارد ورم پستان و اگزودا , چرک وسوآپ‌های بینی و مایع لاواژ از موارد دیگر نمونه‌های مناسب برای پاستورلا است
(  (Quinne et al.,

  در مشاهده مستقیم کوکوباسیلها یا باسیل‌های گرم منفی کوچک  دیده می‌شوند که در موارد سپتی سمی همانند وبای طیور در رنگ آمیزی های رومانوفسکی حالت دو قطبی دارند

 ) al.,1994. (Quinne et

  برای جداسازی کشت بر روی دو محیط مکانکی و ژلوزخوندار بسیار مفیداست                         ((Quinne et al.,1994. اصولا پاستورلا ها بر روی محیطهای کشت بلادآگار, نوترینت آگار و شوکلات آگار رشد می کنند.هر چند ژلوزخوندار حاوی 5% خون گوسفندی یا گاوی در جداسازی آنها موثرتر می با شد(Dziva et al., 2007 ) عموما سواپهای بینی یا بافت لوزه نمونه‌های مناسب برای جداسازی نمونه‌هااز حاملین یا عفونت های حاصله از دستگاه تنفسی فوقانی است. در موارد سپتی سمی هموراژیک و وبای مرغان خون قلب یا ارگانهای احشای از لاشه تازه نمونه‌های مناسبی می‌باشند.  با این وجود اگر لاشه تازه نباشد می‌توان از مغز استخوان ویا بافت مغز بدین منظور استفاده کرد          (Dziva et al., 2007)

اگر در مواقعی قصد جداسازی باکتری مذکور از میان فلور طبیعی  حیوانات وجود داشته باشد می‌توان از محیط های کشت انتخابی استفاده نمود.محیط کشت هایKnight  برای جداسازی عامل از توله خوکها طراحی شده است.محیط های کشت انتخابی آگار و براث پاستورلا مولتوسیدا                (Pasteurella multocida selective enrichment broth and agar) طراحی شده‌اند. نتایج جداسازی این محیطهای کشت متغییر می‌باشد. افزودن آنتی بیوتیک های همانند کلیندامایسین، جنتامایسین، نئومایسین، آمیکاسین، ونکومایسین و کانا مایسین نتایج مشخصی را در پی نداشته است (Dziva et al., 2007).اخیرا ژلوز دکستروز نشاسته وتریپتوز سویا آگار برای جداسازی اولیه به کار می رود.تزریق زیر جلدی داخل صفاقی و حتی عضلانی نمونه‌های پاستورلا مولتوسیدا در موشهای عاری از پاستورلا موجب مرگ موش در 24 تا 48 ساعت شده و باکتری را می‌توان بصورت خالص از طحال, کبد و خون قلب حیوان جداسازی نمود.از موشها در شناسائی حاملین پاستورلائی نیز استفاده می‌گردد.هر چند این روش را می بایست در نبود سایر روشها به کار بردDziva et al., 2007)).انکوباسیون در 37 درجه به مدت 48-24 ساعت مناسب است. توصیه می‌گرددافزودن 5-10 درصد CO2 در جار بی هوازی،رشد میکروب ها را تسریع   می کند (Quinne et al.1994)

تعیین هویت باکتری: کلنی های پاستورلایی در عرض 24 ساعت انکوباسیون رشد می‌نمایند.اندازه کلونی‌های مذکور متوسط, غیر همولیتیک, کروی و متمایل به خاکستری است. درخصوص تیپ A پاستورلا مولتوسیداکلونی هااغلب حالت موکوئیدی دارند که این امر مربوط به کپسول اسید هیالورونیکی باکتری مذکور است. بوی خاصی از پلیت پاستورلا مولتوسیدا تولید می‌گردد که برخی آن را مربوط به تولید اندول از سوی این باکتری می دانند(Quinne et al.,1994)

شکل کلنی را در ارتباط با میزبان نیز دانسته‌اند بدین ترتیب که کلنی موکوئیدی اغلب ناشی از ضایعات ریوی گاو، خوک وخرگوش بوده در حالیکه کلنی های غیر موکوئیدی حاصل از نمونه‌های طیور استDziva et al., 2007))

نمای میکروسکوپیک:اسمیر حاصل از کلنی ها کوکوباسیل یا باسیلی شکل گرم منفی با اندازه کوچک می‌باشد

3-2-1واکنش های بیوشیمیایی:

واکنشهای بیوشیمیائی وسیعی در شناسائی پاستورلا   مولتو سیدا  تعریف شده است که عملا تعداد کمی از آنها در آزمایشگاههای روتین وجود دارد.مو رفولوژی کلنی،  بوی پلیت،آزمایش کاتالاز واکسیداز از عمده روشهای تفریق می‌باشند.محیط کشت مکانکی در تفریق پاستورلا مولتوسیدا و منهمیا همولایتیکا از هم نقش اساسی دارد. پاستورلا  مولتو سیدا بر خلاف باکتریهای گرم منفی دیگر درتست   آنتی بیوگرام نسبت به پنی سیلین حساسیت از خودبروز میدهد (Quinne et al.,1994)

امروزه جهت تایید تشخیص دو روش استفاده از نمونه‌های استاندارد (جدول 2-1) و نیز استفاده از روشهای فنوتیپی در کنار روشهای ژنتیکی حائز اهمیت فراوانی است. سیستمهای نیمه اتوماتیک نیز (API:Analytical profile index ) در جهت تشخیص پاستورلا مولتوسیدا استفاده می‌شود                 ( Dziva et al., 2007).

4-2-1- روشهای تعیین تیپ

1-4-2-1- روشهای تعیین فنوتیپ

الف- تقسیم بندی بر اساس شکل کلنی

این تقسیم بندی بیشتر به هدف استفاده در آزمایشگاه کاربرد دارد بر همین اساس کلنی های حاصل از پاستورلا مولتوسیدا را به 3 دسته تقسیم می کنند

   دسته اول:  کلنی های موکوئیدی

    دسته دوم:  کلنی های صاف یا فلورسنت

    دسته سوم:  کلنی های غیر کپسول دار یا خشن

کلنی های موکوئیدی بر روی محیط کشت جامد بزرگ و حالت لزج دارند و در محیط مایع رسوبی موکوئیدی و چسبناک اند.حساسیت این کلنی ها برای موش متوسط است.در مقابل کلنی های صاف اندازه ای متوسط داشته و قوامی سفت دارند و حالت منتشر در محیط مایع داشته و حدت آنها برای موش بالاست ( Carter, 1955 )

کلنی های دسته سوم کلنی های خشن ( آبی ) نامیده می‌شوند که اندازه ای کوچک داشته و سفت می‌باشند.این کلنی ها در محیط مایع حالت اتوآگلوتیناسیون ( Autoaglutination ) پیدا کرده و حدت آنها برای موش اندک است.البته حالات بینابینی برای این کلنی ها نیز مشاهده می‌شود.این نوع از کلنی ها در پرندگان و یا در سویه هایی دیده می‌شوند که بیش از اندازه در محیط های مصنوعی کشت داده شده‌اند   ( Carter, 1955 )

 ب- روشهای سرمی

روش روبرت:

در سال 1947 روبرت نشان داده که پاستورلاها را می‌توان بر پایه  کپسول 4 دسته1 و 2 و 3 و 5 تقسیم نمود. این روش بعدها تحت تاثیر روشهای دیگر قرار گرفته و دیگر کاربردی ندارد

روش کارتر:

این روش تقسیم بندی از مقبولترین روشهایی است که از زمان ابداع تا کنون به عنوان یکی از بهترین روشهای تعیین تیپ پاستورلا مولتوسیدا مطرح می‌باشد

بر اساس این روش در سال 1955، Carter با استفاده از آزمایش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم                 (Indirect  Hemaglutation ) موفق به طبقه بندی پاستورلا مولتوسیدا شد. در این گزارش تکنیک هماگلوتیناسیونی بر روی عصاره حاصل از پاستورلا با استفاده از گلبولهای قرمزانسانی طراحی گردید.بدین ترتیب که گلبولهای قرمز ابتدا بواسطه عصاره حاصل از باکتری حساس شده و پس از آن به غلظت مناسبی از سرم اختصاصی اضافه می‌شدند، پاسخ مثبت با هر سرم منجر به تعیین تیپ می گشت

بر همین اساس Carter پاستورلاها را به سروتیپهای D , B , A طبقه بندی نمود. تیپی تحت عنوان C نیز از سویه های سگ و گربه گزارش گردید ( 1955، Carter )

بعدها Carter خود طی مطالعات بر روی سویه های آفریقائی تیپ جدیدی از پاستورلا مولتوسیدای جدا شده از سپتی سمی هموراژیک در آفریقا تحت عنوان تیپ E گزارش نمود.تیپ دیگر نیز از بوقلمون توسط Rimler  وRhoades  گزارش گردید.که به تیپ F معروف است.امروزه تیپهای F , E , D , B , A  از سویه های مذکور گزارش گردیده اند ( Rimler and Rhoades,  1989 )

تیپ کپسولی A را از وبای مرغان، آبریزش بینی راجعه ( Snuffles ) خرگوش و درگیریهای تنفسی نشخوارکنندگان، خوک، سگ و گربه گزارش نموده اند.اگر چه تیپ D کپسولی غالب در رینیت آتروفیک خوک است اما آنرا از پنومونی سایر گونه ها نیز گزارش کرده‌اند. تیپهای کپسولی E , B منحصر به سپتی سمی هموراژیک به ترتیب در مناطق حاره ای آسیا و آقریقاست. در حالیکه تیپ F را عمدتا از بوقلمونهای بیمار جدا نموده اند.با این وجود، در بسیاری از مطالعات جدایه‌های پاستورلا مولتوسیدا برخی از پاستورلاهایی که توان تیپ بندی نداشته اند وجود دارد   ( Catry., 2005)

در سال 2001، Townsend و همکاران بر اساس جایگاه کپسولی روشی مبنی بر Multiplex  PCR طراحی نموده اند که این روش در روش تعیین تیپ بسیاری از نواقص روش Carter را ندارد                  ( Shivachandra  el at , 2005 ) (برای اطلاع بیشتر به فصل مروری بر مطالعات گذشته رجوع گردد)

روش نامیوکا و موراتا: